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基因探針法PCR試劑盒產品及特點:
1. 一管式操作,用戶只需要提供樣品即可。
2. 根據(jù)大豆熱休克蛋白基因保守區(qū)域設計引物,能專一性檢測出樣品中的大豆成分,但不能檢測其他非大豆成分。
3. 快速,整個檢測過程(按一個樣品計)所需時間僅為 2.0 小時。
4. 只需要普通 PCR 儀和凝膠電泳儀,無需配置貴重儀器設備。
5. 對混合樣品中大豆成分的檢測下限為 0.1%,對樣品中大豆成分的核酸檢測下限為 1.0ng/μL。
6. 本只能用于科研,足夠 50 次 40uL 體系的常規(guī) PCR。
基因探針法PCR試劑盒五要素:
①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現(xiàn)二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
基因探針法PCR試劑盒操作步驟:
1.液氮充分研磨樣品。
2.收集研磨成粉末的50mg樣品,置于1.5ml離心管中。
3.加入350μl65℃預熱的緩沖液IL,并加入20μl蛋白酶K劇烈地漩渦振蕩,確保所有的組織團都分散均勻。
4.65℃水浴20-30min。水浴期間顛倒樣品數(shù)次。
5.加入350μl,充分混勻,12,000 rpm(~13,400×g)離心5分鐘。
6.小心地把上清液吸至另一新的1.5ml離心管中。注意確保不要打散沉淀團或把組織碎片也一起轉移。
7.加入4μl RNase A,渦旋混勻。室溫放置2min。
8.加入二分之一上清體積的緩沖液IB與等體積的無水乙醇,充分混勻。如:向300μl上清中加入150μl緩沖液IB與300μl無水乙醇。
9.把上述混勻基因探針法PCR試劑盒的液體轉移到吸附柱上。10,000×g離心1 min以結合DNA,棄去濾出液體。純化柱*容量為750μl,如果混合液大于750μl,請分兩次過柱。
10.將吸附柱重新套回收集管中,加入500μl緩沖液WB至柱子中,10,000×g離心1min,倒棄流出液;
11.將吸附柱重新套回收集管中,加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中,10,000×g離心1min,倒棄流出液;