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LAMP Loop DP-Probe (訂制品)

簡(jiǎn)要描述:

LAMP Loop DP-Probe (訂制品)公司正在出售的產(chǎn)品:SUNE-1亞株-5-8F 生長(zhǎng)抑制因子基因1封閉多肽 牛丘疹性口炎病毒PCR檢測(cè)試劑盒 大鼠凝血抗凝血復(fù)合物(TAT)ELISA Kit 海藻糖活性比色法檢測(cè)試劑盒 獨(dú)島海單胞菌 環(huán)指蛋白9抗體

更新時(shí)間:2024-01-12

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LAMP Loop DP-Probe (訂制品)

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!

貨號(hào)

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

A-PJ1021

LAMP Loop DP-Probe (訂制品)

800Tx25μl

該 DP-Probe(DisPlaceable Probe)為鏈置換熒光探針,專用于LAMP 的熒光擴(kuò)增。Loop DP-Probe 在搭配 HotStart Bst4.2 Basic 試劑時(shí)表現(xiàn)出極為出色的特異性,可以大幅降低非特異性擴(kuò)增。LoopDP-Probe Pair 是將 Loop 引物進(jìn)行改造(LF/B 任意一條均可),其由兩條標(biāo)記引物退火組成:熒光猝滅引物(5’IBFQ+Tail+Loop)和熒光報(bào)告引物(Tail 互補(bǔ)區(qū)+3’發(fā)光基團(tuán)),其不發(fā)熒光。在 LAMP反應(yīng)中 Loop 引物滲入到“啞鈴"結(jié)構(gòu),由擴(kuò)增返回“啞鈴"延伸并置換游離的熒光報(bào)告引物,累積產(chǎn)生熒光信號(hào)。有經(jīng)驗(yàn)的研究人員可根據(jù)參考文獻(xiàn)自行制備 LAMP Loop DP-Probe Pair,經(jīng)驗(yàn)不足的人員可委托  來制備, 提供三種熒光標(biāo)記的探針。需要客戶提供 Loop 序列,并指明需要的熒光標(biāo)記(FAM/JOE/ROX)。
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eLAMP DP-Probe 試劑的開發(fā)簡(jiǎn)述
1. 引物的粗篩選
無論是變色、試紙條、熒光法 eLAMP 試劑的開發(fā),前期的測(cè)試過程, 推薦采用價(jià)格較低的液體 HotStart Bst4.2 SYBR Green試劑(進(jìn)行粗篩選。通常篩選的引物為 3-5 組。10xeLAMP Mix:FIP/BIP=8 μM each; LF/LB=4 μM each.測(cè)試樣品:10e3、100、25、10Copies/管,NTC(16-32 重復(fù))
2.5xBst4.2 SYBR Green Mix 10 μl
10x ePrimer Mix 2.5 μl
HotStart Bst 4.2(8U/μl) 1 μl
模板 DNA/RNA X μlddH2O 到總體積 25 μl置于 70°C 反應(yīng) 45min,1min 收集一次熒光信號(hào)。

良好的引物組具有 以 下 特 性 (Ct) :

10e3copies =5-10min; 25copies <15min;10Copies<20min, NTC 均>40min. 以上實(shí)驗(yàn)需要反復(fù)確認(rèn),以確
保核心引物的工作效率,否則重新篩選,再進(jìn)行后續(xù)的其它測(cè)試。
2. Loop DP-Probe Pair 的制備
根據(jù)上述引物組的篩選情況,選取最佳引物組。在此基礎(chǔ)上改造LF 或 LB,改造哪一條效果更佳,必須經(jīng)過測(cè)試。下面以改造 LF為例進(jìn)行說明。 通常提供 25x 的 LF DP-Probe Pair(或自行制備)。

注意:

(1)測(cè)試試劑更改為 HotStart Bst4.2 Basic 試劑。

(2)10xeLAMP Mix 引物濃度有調(diào)整。
10xeLAMP Mix:FIP/BIP=8 μM each; LB=4 μM;LF=3 μM.
2.5xBst4.2 Basic Mix 10 μl
10x ePrimer Mix 2.5 μl
25x LF DP-Probe Pair 1 μl
HotStart Bst 4.2(8U/μl) 1 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
置于 70°C 反應(yīng) 45min,1min 收集一次熒光信號(hào)(注意根據(jù)探針熒光標(biāo)記,選取正確的熒光通道)。與 SYBR Green 結(jié)果相比來看,時(shí)間會(huì)滯后 1-3min。NTC 的控制會(huì)明顯提升。

此時(shí)可進(jìn)一步做后續(xù)的其它項(xiàng)目測(cè)試。
3. 如有試劑凍干制備的需求可采用如下幾種方案:
(1)(液體試劑)+PrimerMix 自行凍干(專業(yè)人員使用)。
(2)PrimerMix+(引物凍干劑)自行凍干,加入 (凍干球)。
(3)(HotStart Bst4.2),全程自行凍干(專業(yè)人員使用)。
(4)委托  進(jìn)行全體系凍干。

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PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備?

試劑:
模板DNA:PCR反應(yīng)需要模板DNA,如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物,分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程,用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增;Taq DNA聚合酶:PCR反應(yīng)需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴(kuò)增DNA鏈;PCR buffer溶液:對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用,調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛,可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性,從而提高反應(yīng)效率;酶切體系:PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟,常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物;
設(shè)備:
PCR儀:用于控制反應(yīng)溫度,保證PCR反應(yīng)時(shí)不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制;電泳槽:用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn):

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個(gè)循環(huán)組成,每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟:

一、變性:

利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前,通常加熱長(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘,接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性:

在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯(cuò)誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地結(jié)合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。

三、延伸:

DNA聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(zhǎng)度。傳統(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp/min、較新的Tbr(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化:

1、變性溫度和時(shí)間:

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜WC整個(gè)PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng),可對(duì)Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時(shí)間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高,產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時(shí)間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí),過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時(shí)間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長(zhǎng)延伸時(shí)間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意,延伸時(shí)間過長(zhǎng)可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時(shí)間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后,PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值,實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,非特異擴(kuò)增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品:

泰澤隱孢子蟲染料法熒光定量PCR試劑盒

補(bǔ)體C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白1ELISA試劑盒 C1QTNF1/CTRP1免費(fèi)代測(cè)試劑

流感嗜血桿菌B型染料法熒光定量PCR試劑盒

倍贊氏金蠅PCR檢測(cè)試劑盒直銷

叢狀蛋白B1ELISA試劑盒 PLXNB1免費(fèi)代測(cè)試劑

詹姆士城峽谷病毒PCR檢測(cè)試劑盒供應(yīng)

甲型流感病毒H亞型(IAV-H)核檢測(cè)試劑盒

Cullin4B蛋白ELISA試劑盒

貓庖疹病毒PCR檢測(cè)試劑盒

對(duì)蝦白斑病毒PCR檢測(cè)試劑盒

大腸菌ELISA試劑盒

貓庖疹病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

馬節(jié)桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

蛋白酪氨激ELISA試劑盒

古柏線蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒

禽傳染性支氣管炎病毒JMK型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

低分子質(zhì)量蛋白7/β型蛋白體9ELISA試劑盒

傳染性胸膜肺炎放線桿菌(APP)核檢測(cè)試劑盒

病毒H5/H7/H9亞型(AIV-H5/H7/H9)核檢測(cè)試劑盒

丁型肝炎病毒抗體ELISA試劑盒

蘋果黑星病菌染料法熒光定量 PCR 試劑盒

馬科研PCR檢測(cè)試劑盒

對(duì)稱二甲基精氨ELISA試劑盒

流感病毒N4亞型PCR檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)

馬爾太蟲通用PCR檢測(cè)試劑盒

多萜醇磷-N-乙酰氨基葡萄糖磷轉(zhuǎn)移1ELISA試劑盒

牛肺線蟲PCR檢測(cè)試劑盒供應(yīng)

禽傳染性支氣管炎病毒型PCR檢測(cè)試劑盒

DELISA試劑盒

貓杯狀病毒前病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

雷丸染料法PCR鑒定試劑盒

人分泌型卷曲相關(guān)蛋白2(SFRP2)試劑盒ELISA

佩氏著色霉PCR檢測(cè)試劑盒

諾如病毒G4型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

人過氧化物體增殖激活物受體γ輔激活因子1α(PPARGC1)ELISA試劑盒

梨孢鐮刀菌染料法熒光定量PCR試劑盒

艾利希體屬(埃立克體屬)通用染料法熒光定量PCR試劑盒

LAMP Loop DP-Probe (訂制品)人單純皰疹病毒Ⅰ+Ⅱ(HSVⅠ+Ⅱ)抗體(IgG)檢測(cè)試劑盒elisa

變異變形桿菌PCR檢測(cè)試劑盒

梅克爾多元癌細(xì)胞病毒PCR檢測(cè)試劑盒

α1性糖蛋白(α1-AGP)ELISA檢測(cè)試劑盒

環(huán)孢子蟲探針法熒光定量PCR試劑盒

豬藍(lán)耳病病毒通用型(PRRSV-U)核檢測(cè)試劑盒

人補(bǔ)體片斷5a(C5a)ELISA Kit

葡萄孢菌探針法熒光定量PCR試劑盒

 


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